正反向遗传学的研究技术及优缺点（正向遗传学和反向遗传学在应用）

本报记者 谢开飞 通 讯 员 欧阳桂莲

在现代遗传学中，反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具，它彻底改变了人们对病毒发病机制和疫苗研发的认识。近日，一项来自瑞士的研究使用这一工具，依靠已知新冠病毒基因序列，在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。

研究人员认为，快速构建出活的新冠病毒，可以成为向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株的替代方法，从而争取时间对疫情暴发做出快速反应。该研究中所用的反向遗传学技术是什么？在生物科技领域有哪些应用？这种重建病毒的最新研究如何改变对疫苗研发的认识？

由里及表 开辟疫苗研发新思路

“一直以来，科学家们研究相关基因的功能，都是通过杂交等手段，观察表型性状的变化，从而研究遗传基因的存在与变化，这种由表及里的研究方法称为正向遗传学。”厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心副教授程通告诉科技日报记者，如在医学领域，可以观察临床病人病理组织和正常组织的不同表现，从而探究产生这种表现变化的内在原因。

随着分子遗传学及相关实验技术的发展，科研人员已经能够有目的地对DNA进行重组或者定点突变。于是，在现代遗传学中，就出现了另一条由里及表的认知路线。研究人员直接从生物自身基因出发，通过对特定基因进行敲除、定点突变等人工操作后，观察突变体表型与性状变化，从而反推基因功能。由于该路线与正向遗传学正好相反，所以这个新的遗传学分支被称为反向遗传学，包括基因剔除技术、基因改造等研究。

相较于正向遗传学来说，反向遗传学有其独特的优势。

此前，美国哈佛—麻省理工博德研究所科学家塞克·凯斯利森及其同事，就采用反向遗传学方法，对10503个生活在巴基斯坦的人基因编码区进行测序分析，识别出了约50000个突变。这种反向推定的技术路线，相当于高效收集了正向敲除1317个基因找到的结果，相较于传统正向遗传方法，极大地提高了效率。

“与灭活疫苗、减毒疫苗等经典疫苗研发方法相比，反向遗传学操作还具有减毒途径明确、效率高、毒力回复率低等优点，是疫苗研制的新方向。”程通说。

目前，科研人员利用反向遗传学技术，已证实登革热病毒、脊髓灰质炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和乙型脑炎病毒等一系列病毒的毒力相关位点, 通过基因突变、缺失、重排等方法，都有可能获得理想的减毒株来研制疫苗。

据介绍，基于反向遗传学技术的疫苗研究，还可以发现在经典疫苗研发过程中难以发现的“特殊”保护性抗原，为传染性疾病的疫苗研制，以及发展新型多价或广谱疫苗提供新的方向和思路。

补充病毒资源 加速检测技术开发和药物筛选

在新冠病毒感染者病例已经大规模出现的情况下，科学家们为什么还要对其进行人工重建？程通表示，重建病毒将有助于人类了解病毒复制途径，找到其“弱点”和药物作用靶点，是研制病毒相关疫苗与治疗药物不可或缺的技术手段。

虽然新冠肺炎病例已大规模出现，但不同地域毒株常存在差异性，且出于生物安全的考虑，无法在全球范围内任意运输，导致众多科研机构因缺乏新冠病毒资源而难以快速鉴定病毒、验证相关疫苗或治疗药物的有效性。

“新冠病毒重建技术的突破，使得处于不同国家与地区的科学家，能够在各自所处的高等级生物安全实验室内，借助大肠杆菌、酵母菌等基因工程常用微生物，合成当前数据库里具有完整基因组序列的新冠病毒活毒株。”程通说，这有助于解决相关药物评价的关键资源问题，将加快针对新冠病毒的检测、治疗和预防手段的研发。

另一方面，重建病毒还为发现毒力位点与作用机制等提供了工具。通过对新冠病毒进行基因敲除、改变以及其他加工修饰，研究这些基因改造对其致病性的影响，有助于深入了解病毒致病机制，发现可用作药物靶点的新型毒力基因。

此外，通过给病毒加上荧光蛋白等可视化标记，还可实现病毒感染实时监控，从而优化现有新冠病毒的细胞与动物感染模型，为相关疫苗与药物高通量快速筛选进一步提供方便。

目前，国内外科研机构在重建病毒过程中，尚无法脱离反向遗传学范畴。科研人员大都是基于在大肠杆菌或酵母菌等基因工程类微生物内，克隆与改造病毒遗传物质，然后将提纯的病毒基因组转运到宿主细胞中进行活病毒的组装生产。

《科学》杂志曾经报道的脊髓灰质炎病毒重建，由科研人员使用无细胞体外系统完成。由于需要基于该病毒的基因组序列信息来进行实验，当时就将其归属于一种特殊的反向遗传学操作方式。

应用日益广泛 但须受到严格监管且符合科学伦理

当前，反向遗传学技术不仅在不同种类病毒研究上得到非常普遍的应用，而且在疫苗和药物研发上也展现出重要的应用价值。

程通举例说，基于反向遗传学技术改造减毒活疫苗的研究，已在包括2009甲型H1N1流感病毒、登革热病毒、禽流感病毒、水痘—带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒等多种病毒中取得重要进展。

其中，2009甲型H1N1减毒活疫苗已上市并广泛接种，水痘—带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒和登革热病毒等病毒的反向遗传改造减毒活疫苗，已进入临床试验阶段。

此外，基于反向遗传学技术合成的减毒病毒载体或溶瘤病毒类药物，已广泛用于基因治疗与肿瘤治疗临床研究。2015年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准首个溶瘤病毒类药物T-VEC用于治疗晚期黑色素瘤；2017年，美国杜克大学研发的溶瘤脊髓灰质炎病毒，获得了FDA的批准，用于治疗神经胶质瘤。

除了用于重建病毒，反向遗传学技术在细菌等其他微生物，以及植物相关研究上也有广泛应用，并取得了较大进展。

“在细菌研究方面，反向遗传学技术在B群脑膜炎球菌疫苗、肺炎链球菌多价疫苗、肺炎衣原体疫苗、炭疽杆菌疫苗等多种细菌性疾病疫苗的研制中，获得了成功应用。”程通说。其中，B群脑膜炎球菌通用疫苗的成功研制是运用反向遗传学技术研发细菌疫苗的经典案例。

B群脑膜炎球菌是流行性脑脊髓膜炎的病原菌，可导致儿童与青少年患急性化脓性脑膜炎和败血症。然而长期以来，科学家们应用传统技术研制有效和广谱的预防疫苗，一直无法获得成功。

随着基因组学和蛋白质组学技术的进步，瑞士诺华公司的研究人员应用反向遗传学技术，通过分析B群脑膜炎球菌的全基因组，并进一步通过基因组序列比较和动物模型测试筛选，研制出多价B群脑膜炎球菌通用疫苗。

2013年，诺华公司重组B群脑膜炎球菌疫苗获得欧盟批准上市，成为欧洲第一个获得批准的预防B群脑膜炎球菌病的疫苗，并在控制B群脑膜炎球菌流行中被证明安全有效。

“需要特别指出，通过反向遗传学技术重建病毒，是推进相关科学研究的有力工具，但这些实验操作必须受到严格的监管，需符合科学伦理，并严格限定在合格的生物安全实验室中开展。”程通说。